血栓从来就不是只属于某一个科室的特定疾病，随着医学高速发展，人们对血栓认知也越来越深刻，那么在临床工作中，如何科学开展抗凝治疗给一线的医生提出了不小的挑战。这篇医院李健教授和王成彬教授撰写的文章，为我们打开靶向医疗时代抗凝监测新篇章。
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直接口服抗凝药的出现一改抗凝治疗剂量优化繁复的局面，以其特异性作用降低了静脉血栓复发和严重出血风险。同时，一些经过药监注册的新型标志物开启了临床应用的新阶段，不仅为靶向抗凝提供了针对性的评估手段，而且也填补了判断进行性血液凝集的空白。临床医生自此得以采取"总体凝血表现－有效抗凝剂量－凝血酶生成－纤维蛋白生成"的分层式主线分析监测治疗，减少了既往交叉网络式凝血机制带来的困惑。从直接口服抗凝药的临床应用出发，分析了抗活化Ⅱ因子和抗活化Ⅹ因子活性评价抗凝有效性的优势，进而提出直接或间接反映凝血酶活化程度的凝血酶生成试验和凝血酶－抗凝血酶酶复合物是体现直接抗凝效果的重要参数，以及纤维蛋白单体作为纤维蛋白生成早期标志物对评价凝血酶受抑制程度的独特作用；讨论ⅩⅢ因子作为纤维蛋白形成过程的关键环节在出血病因分析中的潜在价值。新型标志物和手段有别于传统凝血指标评价多种凝集蛋白活性的综合表现，而是以反映单一靶标的活性或受抑制程度来准确分析抗凝疗效或血栓预后，从而将止血血栓检验带入了一个新时代。(中华检验医学杂志，,40：－)
数十年来，整体凝血功能试验在术前出血风险评估、凝血因子缺乏性疾病筛查、口服维生素K拮抗剂(vitaminKAntagonist，VKA)和普通肝素抗凝的疗效评估中发挥了重要作用。如VKAs的治疗剂量需要2至4周时间通过国际标准化比值(InternationalNormalizedRatio，INR)进行调整，INR2.0时复发vte风险增高，inr3.0时主要出血事件增加，因此需定期检测INR来监测抗凝治疗效果。另一方面，频繁的有创检查也降低了患者依从性，难以保证药物效果的稳定，增加了治疗风险。为了减少定期监测并提高药物的安全性，新型的直接口服抗凝药(directoralanticoagulants，DOACs)应运而生，近年来的大量临床试验证明，DOACs治疗非瓣膜性房颤(non－valvularatrialfibrillation，NVAF)和急性静脉血栓栓塞症(venousthromboembolism，VTE)的安全性和有效性优于VKAs和普通肝素，然而，部分患者(肾病、老年等)因药物代谢差异，其用药安全仍有必要监测。在药物更新换代的大背景下，传统凝血筛查试验的局限性逐渐暴露出来，成为临床亟需解决的问题。
单靶点抗凝治疗呼唤靶向监测
直接口服抗凝药包括活化X因子(Xa)抑制剂和活化II因子(IIa)抑制剂(直接凝血酶抑制剂),其中前者(利伐沙班,阿哌沙班等)通过阻断凝血酶原转化为凝血酶而发挥抗凝作用,后者(达比加群等(达比加群酯等)选择性地与可溶性或纤维蛋白结合的凝血酶作用,防止凝血级联反应放大,阻止纤维蛋白原转化为纤维蛋白?
临床常用剂量的利伐沙班可使凝血酶原时间(prothrombintime,PT)延长,延长程度与血药浓度仅呈弱相关,且存在着试剂依赖的变异性?PT除了受试剂类型多样性及检测系统差异的影响之外[4],检测低剂量达比加群酯的灵敏度低且变异性大[5],PT正常仅用于排除血药浓度高的可能,或者说抗凝过量的风险较低?此外,PT用于监测阿哌沙班也有灵敏度低?可靠性差?实用性局限的问题[6]?
活化部分凝血活酶时间(APTT,ActivatedPartialThromboplastinTime)对于利伐沙班的敏感性比PT更低[7],也不适合监测阿哌沙班剂量[8]?由于缺乏剂量依赖关系,APTT不能可靠地判断达比加群酯剂量达标与否,个体差异显著而且同样受仪器和检测试剂的影响[9-10]?例如,18%的达比加群酯抗凝剂量达标者的APTT仍在健康人参考区间内,而美国血液学会指南曾提出,APTT正常可排除达比加群酯剂量过高导致的出血;英国血液学标准委员会指出ng/mL达比加群酯可使APTT延长,APTT比率正常基本可以排除达比加群酯过量[11],而现实情况是,15%~35%患者在剂量高于ng/ml时APTT仍未延长[12],因此APTT并不是该药监测的可靠手段?由此看来,APTT变异性大的难题从方法学建立伊始,历经肝素剂量监测到新型口服抗凝药面世,一直制约着其自身有效应用?
凝血酶时间(thrombintime,TT)对低剂量达比加群酯非常敏感[13],随着浓度增加出现明显延长,剂量较高时TT就超出检测上限[14],简言之,TT正常提示血浆中没有或仅有很少达比加群,一旦显效则TT迅速超出检测上限?活化凝血时间(Activatedclottingtime,ACT)对达比加群酯治疗剂量缺乏敏感性,只与高血药浓度相关:APTT正常可以排除50%以上的过量者,ACT或PT正常可以排除75%?
上述通过血浆凝固时间反映抗凝活性的试验有助于判断显效与否,但由于由于缺乏良好的剂量-效应关系,临床上难以通过凝固时间长短来调整剂量,而且这种定性试验存在误判风险?
以抗凝活性为中心的有效剂量监测
普通肝素(unfractionatedheparin,UFH)?低分子肝素(lowmolecularweightheparin,LMWH)和磺达肝癸钠用于急性期静脉血栓的标准治疗?为了安全有效地使用UFH,治疗范围通常维持APTT处于正常值的1.5~2.0倍,实际上这种方式是囿于APTT技术局限性的选择,依赖于试剂种类的治疗区间不能完全纠正APTT的变异?即便用自动化凝血分析仪测定血浆肝素浓度与APTT,两者间无论是线性回归还是对数转换,偏差和相关系数仍有很大变异,从而影响临床决策的可靠性?在启动抗凝治疗时,根据体重计算的固定剂量LMWH皮下给药,减少了对实验室监测的依赖?尽管LMWH和磺达肝癸钠显著降低了出血风险,仍然需要评估部分患者体内药物的抗凝活性,对于肌酐清除率低于30ml/min的肾功能受损患者,需要减量?延长注射间隔?改用UFH(大分子量片段较少经肾脏代谢),必要时需监测抗Xa?
抗Xa活性试验定量检测的是血浆中肝素类药物的抗凝水平,与血浆利伐沙班水平相关性良好,用药物标准品绘制抗Xa定标曲线降低了反应变异性并提高了灵敏度和特异性[15]?根据抗Xa标准曲线校准APTT减少了不同试剂对肝素敏感性的差异造成的复杂干扰,CAP和ACCP推荐肝素治疗时基于APTT参考区间的抗Xa活性为0.3~0.7IU/ml?对于狼疮抗凝物阳性?内源性凝血因子(Ⅷ?Ⅸ?Ⅺ)或者接触因子(Ⅻ,激肽释放酶,高分子量激肽原)缺乏的患者,用APTT监测UFH也不可靠,应选用抗Xa活性试验?一岁以下的儿童因抗凝血酶浓度各异且APTT反应不确定,也推荐抗Xa活性试验定量监测肝素使用[16]?
蝰蛇毒凝血时间(ecarinclottingtime,ECT或ecarinchromogenicassay,ECA)和稀释凝血酶时间(dilutedthrombintime,dTT)受制于方法学的最低检出限(主要是定标品的因素),对低于30-40ng/ml需要浓度的达比加群酯敏感性不足,但对治疗剂量和超剂量达比加群酯的敏感性良好,体内和体外实验都显示上述试验与血药浓度的良好线性关系[17],能够反映治疗剂量范围内达比加群酯的准确剂量?
利伐沙班的Ⅱ期临床试验表明血药浓度与VTE或出血有关[18],Ⅲ期临床试验改为每日固定剂量不再实验室监测?实际上,服用DOACs后血浆谷值和峰值波动很大[19],不利于确定治疗范围和报告解释?更为危险的是,目前国内还没有针对DOACs的适当逆转药物,达比加群酯尚可通过血液透析缓解,利伐沙班和阿哌沙班由于与蛋白结合牢固,即使血透也难以有效逆转抗凝效应?因此处理大出血事件,了解药物浓度有助于分析原因?
方法学标准化有助于减少结果变异性,比如严格控制DOACs服药和采血之间的时间,可避免药物代谢造成的结果波动,便于DOACs浓度的解释?目前绝大多数临床实验室还不能开展对抗Ⅹa和Ⅱa(明确一下是抗Ⅹa和Ⅱa还是Ⅹa和Ⅱa)Ⅱa活性检测,就出现了用PT?APTT或者TT大致判断DOACs抗凝效果的方式,但是传统凝血功能检验的准确度和可靠性有限[20],其结果需谨慎解读?目前存在的问题是,基于发色底物法的抗Ⅹa活性检测可受到高胆红素和高脂血症影响,同时UFH具有抗Ⅹa和抗Ⅱa的双重作用,单纯抗Ⅹa不能完全涵盖其全部抗凝活性,如Ⅱ?Ⅶ?Ⅸ等因子的活性?此外,部分医生误把Ⅹ因子活性检测误认为抗Ⅹa活性定量来申请,也提示加强宣传沟通的必要性?
以凝血酶生成为中心的抗凝效果监测
抗Ⅹa活性和抗Ⅱa活性分析有助于临床调整血浆DOACs的有效剂量,但是剂量与疗效之间还有多个重要环节;如不同患者体内同等活性剂量水平抑制凝血酶的程度不一,最终将表现为疗效差异,故凝血酶生成是关系抗凝治疗成败的关键环节?
Ⅹa直接抑制剂和Ⅱa直接抑制剂分别以Ⅹa因子和Ⅱa因子活性部位为作用靶点,最终都减弱了凝血酶的生成?因此,凝血酶生成试验(thrombingenerationtest,TGT)可能是反映DOACs抗凝效果的理想手段,需注意,其评估效果存在部分争议[21-22],主要原因是半自动方法缺乏标准化以及研究方法的差异,这种缺乏共识的局面有待全自动分析仪上市后得到改善?考虑到血栓形成仅需极少量凝血酶的参与,以nMol数量级表达的凝血酶生成量远比以“秒”为单位表达的血浆凝固时间要灵敏得多?此外,无论是抗Ⅹa活性还是dTT,反映的都是个别凝血因子的抑制情况,不是总体抗凝效果,凝血酶生成试验则通过血液凝固速度与强度来反映总体趋势,因此可能更加客观和接近体内效应?
血液中半衰期很短的凝血酶-抗凝血酶复合物(thrombin-antithrombin,TAT)可以间接评估药物抑制凝血酶活化的程度?在全髋关节置换术(totalhipreplacement,THR)和全膝关节置换术(totalkneereplacement,TKR)中,凝血酶生成试验?TAT?凝血酶原片段1+2(F1+2)和D-二聚体显著增加[23],只不过存在时序差异而已,THR时F1+2?TAT和DD在新股骨材料植入时达到峰值水平,而TKR则在止血带解开之后?实际上,代表着凝血酶原活化?凝血酶生成和纤维蛋白降解的三个指标在抗凝治疗时反应不是同步的;服用达比加群酯后F1+2没有显著变化,D-二聚体有降低但仍处于高值水平,TAT降低后仍高于初始水平,这种差别具有重要提示意义:个体的凝血功能受到药物抑制时,仍有部分凝血酶原未被完全阻断,形成了少量的凝血酶维持着最低凝集能力,同时也有继续形成栓塞的可能?因此,凝血酶生成量的多寡是栓塞风险大小的关键,随着研究的持续深入,期待未来有望发现用于预防血栓的临界值?
以纤维蛋白相关标志物为中心的出血和血栓监测
年以来,止血-血栓学检验发展的重要内容之一是D-二聚体的普及应用?在历经了特殊患者高阳性率?表达单位差异?如何建立年龄或孕龄分级临界值和危急值等争议之后,初步达成了一些共识?此外,纤维蛋白单体(fibrinmonomer,FM)检测从基础研究进入临床应用领域则进一步提高了纤维蛋白相关标志物的临床价值?
凝血酶生成后,催化纤维蛋白原裂解掉纤维蛋白肽,剩余片段形成FM,FM在一定程度上反映了凝血酶生成或者说凝集启动?从过程上讲,FM的出现不仅早于D-二聚体,理论上在未形成可检出的FDP之前即形成FM,在弥散性血管内凝血(DIC)?深静脉血栓和肺栓塞以及术后显著增高,因此具有潜在的血栓预警优势?值得注意的是,围手术期FM的改变不同于长时间居高不下的D-二聚体和FDP,它表现为创伤或术后FM迅速降至参考区间以内,提示外部损伤停止后血液凝固趋势的减弱,这种迥然不同的变化趋势为术后血栓的预后评估提供手段?在利用D-二聚体和FDP判断纤溶活性和凝块降解的同时,FM可帮助医生得以评估抗凝治疗中凝血酶被部分抑制后的剩余活性裂解纤维蛋白原的能力,或了解患者术后是否仍存在血栓形成趋势[24]?
FM及其复合物不具备止血能力,需要活化的ⅩⅢ因子(FⅩⅢa)和钙才能发挥作用,FⅩⅢ通过血小板膜上GPIIb/Ⅲa受体与之结合并在Ca2+的参与下使可溶性纤维蛋白复合物交联,增强对纤溶的抵抗,发挥稳定凝块的作用?FⅩⅢ在凝血中所处的关键环节,决定着它在血栓形成或损伤出血中重要作用?FⅩⅢ重度缺乏者多有显著的出血倾向,值得注意的是,原因不明的术中凝血障碍并出血者围手术期FⅩⅢ显著低下,即使FⅩⅢ达到60%术后出血倾向仍然较强?传统的凝块溶解试验仅适于检出重度FⅩⅢ缺乏,轻中度缺陷则需要通过免疫比浊法ⅩⅢ活性定量加以评估?
包括PT?APTT?Fbg、PLT计数和PLT功能试验在内的传统出血筛查适于检出先天性或获得性血友病等出血性疾病,不能反映FⅩⅢ活性减低[25]?术前凝血功能筛查正常的患者可能出现术后创面渗血?止血延迟?反复出血或血肿,即使进行一般凝血因子活性分析也难以发现问题,有必要考虑FⅩⅢ低下的可能,特别是肿瘤患者接受手术或抗凝治疗后的意外出血?
抗凝药物的靶向性要求疗效监测的特异性,对现有检验手段提出了新的挑战;讨论血栓或出血的靶向监测,并非因新型药物而起,也并非由功能靶点而延伸,而是创新技术将既往基础研究的方法转化为临床应用,为诊断和治疗监测带来机遇?新型药物监测手段的出现不仅弥补了传统实验室监测的空白,而且将诊断水平带入了一个监测目标明确?药物疗效可控的新时代?
（参考文献略）
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