杂志：美国心脏病学会杂志
时间：年12月15日
影响因子：20.
摘要
背景：微血管功能障碍在HFpEF的发病机制中起重要作用。然而，尚未研究全身微血管与充血（该综合征的中心特征）之间的机制联系。
目的：本研究旨在探讨HFpEF中毛细血管-间质液体交换，包括淋巴引流和高渗组织Na+过量所产生的潜在渗透力。
方法：对年龄、性别分布相似的HFpEF患者和健康对照者（每组16例）进行：1）皮肤活检，进行血管免疫组化、基因表达和化学（水、Na+、K+）分析；2）静脉闭塞容积描记术评估外周微血管过滤系数（测量毛细血管液体外渗）和等容压（高于等容压淋巴引流不能补偿液体外渗）。
结果：与对照组比较，HFpEF患者的皮肤活检显示小血管和淋巴管稀疏（p=0.和p=0.）；残余皮肤淋巴管直径增大（p=0.），淋巴分化和功能标志物表达降低（LYVE-1[淋巴管内皮细胞透明质酸受体1]：p0.05；span=""PROX-1[prospero同源框蛋白1]：p0.）。HFpEF患者的微血管滤过系数较低（小腿：3.30[四分位间距（IQR）：2.33至3.88）]×ml组织-1×最小值-1×mmHg-1对4.66[IQR:3.70至6.15]μl×ml组织-1×最小值-1×mmHg-1；p0.01；前臂：5.16[IQR:3.86至5.43]l×组织-1×最小值-1×mmHg-1对5.66[IQR:4.69至8.38]μl×ml组织-1×最小值-1×mmHg-1；p0.05），与血管稀疏和未观察到任何高渗性皮肤Na+过量相一致，但淋巴引流受损（HFpEF患者与对照组受试者的等容压：小腿16±4mmHg对22±4mmHg；p0.；前臂17±4mmHg对25±5mmHg；p0.）。span=""
结论：HFpEF患者的外周淋巴管表现出结构和分子改变，不能通过相应的引流有效地补偿液体外渗和间质积聚。淋巴储备减少可能是一个新的治疗靶点。
关键词：水肿；心力衰竭；间质；淋巴管；微循环；保留射血分数；血管稀疏。
缩写和首字母缩略词：BNP,B型利钠肽；BP,血压；CVP,中心静脉压；DD,深层真皮；ESD表皮和浅层真皮；HC,健康对照组；Kf,微血管过滤系数；Pi,等容压；PV,静脉压；VEGF,血管内皮生长因子
中央插图
HF是发病率和死亡率的主要原因（1）。目前心衰住院率增加的趋势主要是由HFpEF引起的，其1年预后几乎与HFrEF患者一样差（2，3，4）。
HFpEF是一种与多种心血管共病和危险因素密切相关的临床综合征，如高血压、肥胖、冠心病、糖尿病、心房颤动和慢性肾病（5）。这些共病不仅与HFpEF相关，而且可能通过共病相关的炎症和冠状动脉微血管功能障碍直接参与其发病机制的观点（6）已经得到大量尸检、非侵入性和侵入性证据的支持（7、8、9）。除了冠状动脉血管床，外周血管也出现功能障碍（8）。特别是，HFpEF患者的全身血管舒张储备受损和骨骼肌毛细血管密度低，以及与微血管稀疏平行的外周血氧摄取低，被报道为运动不耐受的决定因素（4,10,11,12）。这样的发现挑战了纯粹心脏疾病的范式，支持更系统的现象（13）。然而，功能失调的微循环是否以及如何直接影响充血，“心衰综合征的核心”（5），还没有被研究。
近年来，通过重新评估组织钠（Na+）的积累，对体液内稳态的理解不断发展。这种现象被认为是非水依赖性的（14），并诱导高渗性驱动的淋巴网络扩张，以促进局部Na+排出（15）。值得注意的是，在与临床HFpEF综合征（即老年人、高血压、糖尿病和慢性肾病）相关的大多数条件和风险因素中发现了组织Na+过量（16、17、18），但其高渗性质和功能与HFpEF体液稳态的相关性缺乏证明。
因此，HAPPIFY（HFpEF：间质功能容积描记术和皮肤活检）研究旨在研究毛细血管-间质液体交换，并验证以下假设：高间质Na+水平继发的渗透效应可能影响微血管并导致HFpEF患者液体过多的渗出和水肿。
方法、
研究方案和受试者
来自英国格拉斯哥HF门诊的HFpEF稳定的受试者（n=16），年龄和性别分布相似的志愿者，无心血管或肾脏疾病、高血压或糖尿病病史（健康对照[HC]受试者；n=16），于年8月至年12月招募。HFpEF诊断符合年欧洲心脏病学会指南定义：1）HF的体征或症状；2）BNP升高35pg/ml；3）EF≥50%;结构性心脏病（左心房增大或左心室肥大）或舒张功能障碍的证据（19）。排除标准为近期（3个月）脑血管事件、心肌梗死或冠状动脉血运重建史；严重瓣膜病；不稳定型冠心病；肥厚或浸润性心肌病或缩窄性心包炎；慢性肾脏病分期3期；特发性水肿或毛细血管渗漏综合征、粘液水肿或淋巴阻塞；研究访视时的全身炎症；活动性恶性肿瘤；无持续抗凝治疗的任何严重高凝状态或静脉血栓形成或栓塞史；以及无行为能力。
资格和主要访问是在上午在温度控制室进行的。受试者不摄入咖啡因、酒精或食物；不吸烟；并在评估前避免使用血管活性或利尿药物4小时。研究程序包括病史和体格检查；全血计数、BNP、糖化血红蛋白、肾、肝、甲状腺功能；尿白蛋白与肌酐比值（晨斑样品）；同时测量双侧肱、小腿血压；脉冲波速；超声心动图；内皮依赖性舒张功能；静脉闭塞容积描记术；臀部皮肤穿刺活检。未使用抗凝剂且无严重阻塞性髂动脉疾病史的参与者被提供参与一项可选的亚研究，包括对穿刺活检部位周围的皮肤和皮下脂肪组织进行更大的外科切除，以解剖阻力动脉和分子生物学。本研究符合赫尔辛基宣言，方案得到了苏格兰西部研究伦理委员会3（参考17/WS/）和大格拉斯哥和克莱德NHS研究与发展（参考GN17CA）的批准。
组织样本
所有参与者（除1名患者外，由于麻醉无效）在使用无钠利多卡因乳膏（LMX4，身孕制药集团，Ferndale，密歇根）进行局部麻醉后，在臀外侧上象限进行了4mm皮肤穿刺活检（20）。一半的皮肤样本固定在2%多聚甲醛中进行组织学检查，另一半立即冷冻并在-80℃下保存°直到化学分析。
从符合条件并同意接受亚研究的受试者获得的较大活检的皮肤部分立即冷冻用于分子生物学（7名HFpEF患者和10名HC受试者）；剩余的组织被用于解剖小阻力动脉，通过体外功能测试进行内皮依赖性和非内皮依赖性舒张的离体功能测试。
皮肤组织化学分析
如报告（20）所述，冷冻皮肤样品在冷藏室中被切割成浅表层（包括表皮和浅层真皮[ESD]）和深层真皮（DD），以防止蒸发。在65℃干燥40小时后，使重量稳定，组织含水量被估计为湿重?干重（DW）。通过火焰光度法（C，舍伍德科学公司，英国剑桥）测量硝酸消化后干样品中的组织Na+和K+，用组织水归一化后的绝对含量（mmol/gDW）或浓度（mmol/l）表示。
皮肤微血管成像
石蜡包埋皮肤切片（5-μm厚），包括表皮和真皮，用抗人LYVE-1（淋巴管内皮透明质酸受体1）抗体（RD系统，明尼苏达州明尼阿波利斯；3μg/ml，过夜，4°C类；配对同型山羊免疫球蛋白G作为阴性对照），经过夜低温抗原回收（Unitrieve；InnovexBiosciences，Richmond，California）和非特异性信号阻断。Alexafluor-偶联二抗（2μg/ml；Invitrogen，Carlsbad，California）和乌氏凝集素（10μg/ml；载体实验室（加利福尼亚州伯林盖姆）分别对LYVE-1+淋巴管和血管内皮细胞进行染色。在20倍镜下获得整个表皮和真皮乳头下的贴片图像。采用软件版本1.52q（马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院），对-μm厚真皮区域的微血管进行盲式自动图像分析，从表皮-真皮交界处开始，横跨整个活检长度，根据预定义的均质阈值标准和“分析颗粒”功能（补充图1）。
皮肤基因表达分析
从臀部手术活检中提取RNA。在对目标互补DNA进行预扩增（TaqManPreAmptechnology，AppliedBiosystems，FosterCity，California）后，使用定制的定量阵列卡（ThermoFisherScientific，Waltham，Massachusetts）对特定于血管或淋巴管的标记物或生长和转录因子进行定量基因表达。将β-肌动蛋白作为管家基因进行基因表达水平的比较，结果为ΔCt值。
容积描记术与微血管流体动力学
应变计容积描记术（EC6，Hokanson，Carmel，Indiana）测量肢体体积变化（单位：ml/ml组织），用于评估前臂和小腿动脉血流量、外周静脉压（PV）（作为中心静脉压（CVP）的替代物）以及静脉闭塞压力增加时向间质的净液体外渗，如前所述（21、22、23、24、25）。
简言之，应变计被放置在非优势前臂和同侧小腿上，并保持在右心房的高度。在应变计附近放置用于静脉阻塞的充气袖带。通过逐渐增加闭塞压力来测定PV，持续到检测到任何肢体体积变化。如前所述（22），动脉血流量由连续静脉突然闭塞至45mmHg（E20快速袖带充气机，D.E.Hokanson公司，华盛顿贝尔维尤）周期后肢体体积的变化率确定。动脉血流阻力计算如下：（平均血压?PV）/血流量（24）。
为了评估微血管滤过参数，我们使用了8mmHg的累积闭塞压力步骤，每次持续3.5分钟，从超过PV的第一个倍数开始，如果舒张压较低，则最高可达56mmHg或更低。施加在袖带上并传输到静脉的压力导致静脉扩张和充盈，初始阶段呈曲线状，随后趋于平稳。然而，当超过一定的平衡压力时，通过淋巴引流以相等的速率清除穿过微血管界面的任何液体，就会出现间质液体积聚，从而导致肢体体积线性增加。这个压力阈值称为等容压力（Pi）。在没有运动伪影且不包括静脉充盈期的部分（LabChart，ADInstruments，Sydney，澳大利亚），这些斜率与静水压力成正比，其系数称为微血管过滤系数（Kf）(μl×ml组织-1×最小值-1×mmHg-1）（补充图2C）（21）。过滤系数，以及外渗和淋巴引流平衡时的压力和组织体积的净增加为零（即与x轴的线性关联的截距；Pi），通过最小二乘回归（Prism，版本8；GraphPad作图软件，加利福尼亚州圣地亚哥）。分析中排除3个点无回归拟合运动伪影（21,26）或具有预定义肢体特异性排除标准的肢体。span=""
统计分析
当中期分析显示HFpEF患者Kf高于HC受试者这一主要假设无效时，在每组最初估计的20名受试者中有16名受试者停止招募。所有统计分析均使用Prism和SPSS版本25（IBMCorporation，Armonk，NewYork）进行。分类变量比较采用卡方检验。用图解法和Kolmogorov-Smirnov检验法检验连续变量的正态分布。相应地，使用参数或非参数非配对校正试验比较各组间的主要（微血管）和次要终点。非线性回归和线性回归均采用最小二乘拟合。α水平设为0.05，所有统计检验均为双尾检验。
结果
学科特点与血管功能
两个研究组的临床特征见表1。HFpEF患者和HC患者的年龄和性别分布相似。HFpEF患者表现出典型特征，高血压、肥胖、阵发性或永久性房颤、左心室肥厚、心房重构或舒张功能障碍、糖尿病和慢性肾病的患病率较高。与HC组相比，BNP、蛋白尿、尿素水平升高，eGFR、红细胞压积降低，但血浆白蛋白水平相似。
表1
外周血管功能的经典评估也显示较高的颈动脉-股动脉脉冲波速（作为大动脉僵硬的一种测量方法）和较低的肱动脉血流介导的扩张（伴有较低的缺血后反应性充血）。与HC受试者相比，HFpEF受试者皮下阻力动脉的离体血管舒张作用降低。
皮盐
臀部皮肤活检的化学分析显示，HFpEF患者和HC受试者ESD中的含水量（%湿重[mg/mg干重][未显示]）、Na+浓度（mmol/l水）和总Na+含量（mmol/gDW）相似（图1A）。在DD中，HFpEF患者的水分和Na+含量低于HC受试者（图1B），这与体重指数和皮肤脂肪的分布一致（图1C，补充图5），这限制了水和电解质在组织中的分布体积，同时使它们的相对代表性总体上不受影响。组间DD-Na+和（Na++K+）浓度（即水含量标准化后）相似，如ESD。两层中Na++K+浓度始终在生理范围内（至mmol/l）（20）。同样，皮肤水分和Na+含量回归线的斜率在各组（p=0.）（图1D）或组织层（ESDvs.DD，p=0.）（未显示）之间没有差异。总之，我们没有在HFpEF患者的皮肤中检测到任何高渗、非水依赖性的Na+积聚。
皮肤血液、淋巴微血管稀疏与基因表达差异
微血管
与HC受试者相比，HFpEF患者的皮肤微血管稀疏（p=0.）（图2A和2C），与年龄无关（Spearman与血管数量的相关性：r=–0.，p=0.）。皮肤血管大小、血管内皮生长因子A（VEGF-A）、VEGF-B及其血管特异性受体（VEGF受体1[VEGFR1]、VEGFR2）基因表达无明显差异；血管内皮钙粘蛋白在血管和淋巴管中的表达也没有差异（图2D）。
淋巴微血管
与HC受试者相比，HFpEF患者的淋巴管数量减少（p=0.），但淋巴管更大（p=0.）（图2B和2C）。血管数目和平均大小均与年龄无显著相关性（r=-0.，p=0.；r=0.，p=0.）。在HFpEF患者中，皮肤PROX-1（prospero同源框蛋白1，一种LEC特异性转录因子，驱动淋巴管和瓣膜的发育和动态维持）（27,28）和LYVE-1（淋巴管内皮细胞透明质酸受体1，一种淋巴管内皮细胞的标记物，从最开始的血管开始表达），但与HC受试者相比，podoplanin（一种通常在一定直径以上淋巴管内皮中表达的糖蛋白）没有减少（29）。VEGF-C显示出类似的趋势（p=0.06），但其淋巴特异性受体VEGFR3的表达在各组之间没有差异（图2D）。总之，在HFpEF患者中检测到皮肤淋巴管结构和分子的改变。
微血管流体动力学：微滤和淋巴清除
HFpEF患者的前臂和小腿平均血压、静息肢体血流量（标准化为组织毫升数）和动脉阻力与HC患者相似；在方差分析中，他们的静息pv值更高，尽管没有明显失代偿的迹象（表2）。
微血管动力学
由于运动伪影，3例前臂（1例HFpEF患者，2例HC受试者）和4例小腿（3例HFpEF患者，1例HC受试者）被排除在微滤分析之外；根据特定的排除标准（明显的双侧静脉功能不全），排除1例HFpEF患者的额外小腿追踪。毛细血管液体向间质净渗出（ml）×ml
组织-1×min-1），由近端袖带阶梯性充气引起的PV逐渐升高，在HFpEF高于HC受试者的患者中没有如最初预测的那样增加。事实上，HFpEF患者间质积液与袖带压力之间的回归线斜率低于HC受试者，小腿：（Kf:3.30[IQR:2.33至3.88]μl×ml组织-1×min-1×mmHg-1对4.66[IQR:3.70至6.15]μl×ml组织-1×min-1×mmHg-1；p=0.）；在前臂观察到类似的无显著性趋势（5.16[IQR:3.86至5.43]μl×ml组织-1×min-1×mmHg-1对5.66[IQR:4.69至8.38]μl×ml组织-1×min-1×mmHg-1）（表2，图3）。然而，HFpEF患者的Pi也降低（小腿：16±4mmHg对22±4mmHg；p=0.；前臂：17±4mmHg对25±5mmHg；p0.）：span=""在我们的体内实验设置中，这反映了临界压力，在该压力下，淋巴引流可以完全补偿即使在低PV下液体的持续外渗，并且没有出现净间质液体积聚（即线与x轴的截距）（图3）。
综上所述，在HFpEF中，由于液压（静脉）压力引起的毛细血管外渗，早期间质液的清除不能满足要求。
讨论
我们的HAPPIFY研究首次将微血管功能障碍的概念扩展到淋巴系统，这是对HFpEF的理解。尽管缺乏促进水肿的组织Na+高渗过量，我们发现HFpEF患者的淋巴管在皮肤中表现出结构和分子改变，不能通过相应的引流有效地补偿液体外渗和间质积聚。正如已经在心肌（9）和骨骼肌（11,13）中所描述的那样，除了原发性功能失调的皮下小阻力动脉和皮肤血管稀疏的直接离体证据外，这种功能性和结构性血管损伤进一步支持了HFpEF综合征的系统性本质（13）。
微血管稀疏
血管舒张功能受损是HFpEF患者的既定特征，并导致运动功能障碍（4）。在我们的研究中，这不仅被经典的间接方法如肱动脉血流介导的扩张和缺血后反应性充血所证实，但也通过首次离体分析血管内皮依赖性（通过乙酰胆碱）和内皮非依赖性（通过硝普钠）舒张全身阻力动脉。然而，在体内，任何充血性血流反应也受到最终效应器（即血管）数量的严重影响，猪冠状动脉微血管的实验破坏证明了这一点（30）。在HFpEF患者中，尸检样本中发现的冠状动脉微血管密度降低（9）可能会导致病理异质性和血液供需不匹配（31），从而损害心肌氧提取和性能。类似地，HFpEF的运动能力因外周血氧提取和骨骼肌毛细血管密度降低而进一步降低（10，11，12）。一方面，我们发现HFpEF中的微血管稀疏也发生在皮肤中，皮肤是迄今为止最大的人体器官，也是调节人体血流动力学的关键。另一方面，与前面提到的主要以“动脉为中心”的模式不同，我们的发现促使我们重新考虑微血管作为一个整体的作用，包括除血管阻力外的功能和HFpEF发病机制中除动脉以外的结构。
HFpEF的间质、微血管和充血
充血（即水肿）是HF综合征的核心（5），但据我们所知，这项研究是首次研究HFpEF中毛细血管-间质液体的稳态。
在过去十年中，老年高血压患者（16例）、糖尿病患者（17例）和慢性肾病患者（18例）的皮肤和骨骼肌中有过量的钠离子。这种现象最初在啮齿类动物中被描述为非水依赖性（14），能够刺激淋巴管生成信号通路以增加组织Na+本身的排泄（15）。尽管HFpEF缺乏直接的证据，但所有这些都是该综合征患者的典型共病，我们假设高渗Na+积聚会将多余的液体拖出血管，从而有利于水肿。尽管与先前报道的年轻健康受试者队列（20）相比，HFpEF患者皮肤中的Na+浓度较高，但它也伴有较高的含水量，与年龄分布相似的对照受试者没有区别，可能反映了在我们的稳定型HFpEF患者队列中，在非依赖性部位缺乏明显的HF失代偿和水肿。与年轻健康受试者相比，我们的受试者皮肤中过量的Na+和水分含量让人想起在无并发症的高血压患者中也观察到的年龄依赖性等渗Na+潴留，反映了组织细胞外体积的扩张（20）；在该队列中，研究组之间相同的（Na++K+）浓度排除了任何高渗Na+过量。因此，与我们最初的预期相反，与HC受试者相比，HFpEF患者因液压升高（即Kf）引起的组织液积聚率并不高。与Kf对可用于液体交换的血管表面的依赖性以及在HFpEF中观察到的血管稀疏性一致，Kf实际上较低。HFpEF中的血流可能与HC受试者相似，当按肢体体积标准化时，部分从交换毛细血管转向功能性分流（31）；在其他以局部血流增加为特征的情况下（如体位性心动过速综合征），Kf升高（24）。
与离体制剂不同的是，我们的体内容积描记法不仅解释了Starling-Landis平衡调节的毛细血管液体外渗，而且还解释了液体同时从组织中排出。事实上，当代直接测量的水力学和肿瘤学间质力显示，在大多数情况下，毛细血管床的静脉端没有持续的间质液体再吸收，血管内流动通常是单向的（从毛细血管腔到间质），引流，最多8升/天，由淋巴管提供（32）。假设基于相似血浆浓度的研究组之间的白蛋白渗透压(σΠ)是相似的，超过这个平衡水压，液体净外渗开始过度填充间质(即产生水肿)，这主要是由淋巴引流决定的。我们的研究结果表明，与HC受试者相比，HFpEF患者的手臂和腿部的压力（Pi）更低。较低的Pi和较高的CVP（如表2中的PV值所示）使HFpEF患者的压力范围小得多，可以通过淋巴管进行补偿。换句话说，他们似乎减少了“淋巴储备”。
淋巴系统
淋巴管由一系列协调的功能单元组成，每一个都被称为淋巴管，由管腔内的单向阀隔开，能够自发地泵送活动。他们的生理功能与心脏功能有着惊人的相似性，即收缩-舒张周期和由前负荷和后负荷调节的收缩力，对增加的需求给予显著的可塑性反应（33）。收缩机制、瓣膜功能和机电协调的复杂性表明，功能损害，而不是传统上与大多数继发性淋巴疾病有关的唯一解剖分离，当微血管滤过和淋巴引流之间出现不平衡时，可能导致疾病。确实有人认为，所有“慢性水肿”都可以被视为淋巴水肿的同义词（34），其目的是相对淋巴功能衰竭或储备不足。我们的结果支持了HFpEF中的这一论点。
在皮肤淋巴管中观察到的形态变化，末端毛细血管稀少，残余血管增大，以及淋巴管生成和瓣膜及血管完整性维持的重要因子基因表达减少（27,28），仅提供初步线索，说明是什么导致了HFpEF中观察到的功能缺陷。特别是，我们无法确定因果关系。根据我们的研究结果，我们只能推测，当出现额外的损伤（即，由共病引起的慢性炎症或CVP升高）时，淋巴系统的结构性缺陷或有限的功能储备是否是显性临床综合征的主要易感因素，或相反，是长期损伤的结果，潜在的加性有害影响（35,36）。后者（即，共病和靶器官损害伴舒张功能不全的后果）与Fontan循环患者的形态学改变和最大淋巴泵功能受损的报告一致，慢性增加的CVP会导致后负荷的初始补偿，但长期失效（26）。相反，潜在的易感缺陷会使人想起继发性淋巴水肿的病例，在这种病例中，淋巴引流系统的改变先于淋巴水肿的临床发作，并影响对侧肢体（37,38）。在上肢也检测到淋巴损伤，与我们的一些HFpEF患者的小腿或脚踝相比，两组中均未检测到微量水肿，这表明该现象具有系统性，尽管涉及其他器官特异性微血管床仍有待研究。
不管“哪一个先到”的考虑，淋巴系统预防或最小化水肿发展的能力降低可能标志着无并发症合并症患者和HFpEF患者之间的临床和预后差异（3）。此外，通过针对水肿及其功能失调和炎症的影响，改善淋巴功能可以提高生活质量、肌肉性能和运动耐力；破坏恶性炎症循环；减少利尿剂治疗的需要或剂量，以维持持续的缓解。值得注意的是，尽管常规手术方法不可行，但成功的胸外导管引流治疗晚期心衰已经显示出治疗前景，作为概念证明（39）。
研究局限性
除了上述缺乏因果关系证明（这需要进行更多的专门研究）之外，其他限制也值得一提。选择健康人作为对照组，缺少HFpEF与共病匹配患者的比较；类似地，对有肥胖和无肥胖的HFpEF患者进行比较（35）将进一步确定我们研究结果的特异性。值得注意的是，研究中使用的药物类别，包括钙通道阻滞剂（40），都没有对体内淋巴功能产生不利影响的报道。对于我们的结论，我们假设血浆白蛋白的渗透压相似(σΠ)，离体等容压临界值（32）；由于准确测量血管对白蛋白的渗漏(即σ)在临床环境中是繁琐和不可行的，假设是基于类似的血浆白蛋白浓度。值得注意的是，即使HFpEF中血管的通透性过强，淋巴管提供的相对补偿仍然不足。最后，我们评估了多个生理参数，我们不能排除I型错误的存在；同样，我们的样本量也阻止了HFpEF队列的亚型。
结论
本研究首次描述了HFpEF中淋巴管系统的形态和功能变化，导致渗出液清除率降低。随着皮肤中血液微血管密度的降低，这些发现引起了对全身性微循环缺陷的
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